ELISA檢測原理

    酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，簡寫ELISA）指將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的有無深淺定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

01

ELISA常見分類

#1

直接ELISA

特點(diǎn)： 在直接ELISA中，被測抗原被固定在多孔板表面，用一種針對該抗原的抗體檢測，該抗體直接與HRP或其他檢測分子結(jié)合。

優(yōu)點(diǎn)：簡單快速，避免交叉反應(yīng)。

缺點(diǎn)：潛在高背景，沒有信號放大。

#2

間接ELISA

特點(diǎn)：固相載體包被抗原，酶標(biāo)記二抗，主要用于測抗體。 

優(yōu)點(diǎn)：使用酶標(biāo)二抗增加了靈敏度，靈活大，成本低。 

缺點(diǎn)：交叉反應(yīng)幾率升高。

用途：通過檢測血清中的抗體來檢測病毒，如第1，2代艾滋病診斷試劑。常用于免疫動物血清中抗體含量的測定。

#3

夾心法ELISA(雙抗體，雙抗原）

雙抗體夾心ELISA法

特點(diǎn)：使用兩個(gè)特異性單抗或者1個(gè)特異性單抗和1個(gè)特異性多抗，固相載體包被抗體，酶標(biāo)記特異性抗體作為檢測抗體。

優(yōu)點(diǎn)：使用兩個(gè)特異性抗體檢測，特異性好。

缺點(diǎn)：成本高。

用途：用于抗原的定量檢測。

雙抗原夾心ELISA法

特點(diǎn)：使用兩個(gè)特異性抗原，固相載體包被特異性抗原，酶標(biāo)記特異性抗原作為檢測抗原，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度、特異性高于間接法

缺點(diǎn)：反應(yīng)時(shí)間略長于間接法 

用途：用于抗體的定量檢測。

*RSR多款試劑盒采用橋式ELISA法（基于雙抗原夾心法原理），保證抗體檢測的高特異、高靈敏性。

#4

競爭ELISA

特點(diǎn)：包被抗體，標(biāo)記抗原，樣本中的抗原與酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，標(biāo)本中抗原含量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原越少，最后的顯色也越淺。

注意：該原理強(qiáng)調(diào)抗原與抗體的充分結(jié)合，因此溫度、搖床（振速、振幅）、反應(yīng)時(shí)間等因素值得注意！

用途：小分子抗原或者半抗原的定量檢測，當(dāng)抗原材料中干擾物質(zhì)不易去除或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，多用于此方法檢測；一般小分子激素及藥物常用此法測定。

* RSR旗下AChR Ab-ELISA、TRAb 2nd-ELISA、TRAb 3rd-ELISA等都是基于競爭法ELISA的原理基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的試劑盒，是該項(xiàng)目ELISA定量檢測方法，特異性均達(dá)到99%以上。

02

ELISA常見問題

Q1

為什么推薦兩個(gè)主波長檢測

(450nm和405nm)？

A: ELISA實(shí)驗(yàn)終止后形成的是黃色物質(zhì)，該物質(zhì)需要在450nm處測定其吸光度，當(dāng)OD450值≥3時(shí)，應(yīng)使用OD405的值進(jìn)行轉(zhuǎn)換（乘轉(zhuǎn)換系數(shù)3.4，參見說明書）。

RSR試劑盒中設(shè)計(jì)的空白孔屬于試劑空白，建議按照“空白孔+兩次單波長檢測（405nm & 450nm）"完成實(shí)驗(yàn)，無需再設(shè)置參考波長（630nm）。

Q2

CV值指的是什么？

A: CV值是統(tǒng)計(jì)學(xué)中的一個(gè)概念，中文是變異系數(shù)，可以認(rèn)為變異系數(shù)和極差、標(biāo)準(zhǔn)差和方差一樣，都是反映數(shù)據(jù)離散程度的絕對值。CV值越小，說明數(shù)據(jù)的波動程度越小。在描述板內(nèi)、板間實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否一致時(shí)常用到CV值，其越小，說明批內(nèi)及批間差越小，試劑盒質(zhì)量越好。

Q3

標(biāo)曲擬合方式的最佳方法？

A: 

ELISA數(shù)據(jù)處理中所謂的“標(biāo)準(zhǔn)曲線"其實(shí)更適合稱為擬合曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)根據(jù)不同待測物質(zhì)的特性和檢測范圍選擇適當(dāng)?shù)臄M合方式。除常見的直線、多項(xiàng)式曲線、指數(shù)曲線、對數(shù)曲線等外，四參數(shù)Logistic回歸和三次樣條插值cubic spline擬合對定量范圍內(nèi)全域具有更良好的適用性，能夠比較精確的反映濃度和吸光度間的轉(zhuǎn)換關(guān)系，從而進(jìn)一步準(zhǔn)確獲得樣品中待測物質(zhì)的濃度值。

在RSR試劑盒中，擬合方式可根據(jù)產(chǎn)品說明書自行選擇4 parameters（四參數(shù)Logistic曲線）或cubic spline（三次樣條/仿樣曲線/樣條曲線等），通過酶標(biāo)儀搭配的計(jì)算軟件完成數(shù)據(jù)的處理，從而快速、準(zhǔn)確地完成定量檢測。

Q4

ELISA試劑盒只能檢測血清、血漿、

細(xì)胞上清液嗎？

A: 通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的，在使用前應(yīng)留意試劑盒匹配的樣本類型，包括血清、血漿、腦脊液等常規(guī)樣品，以及尿液、細(xì)組織勻漿液、細(xì)胞裂解液等樣品。對于超出試劑盒適用樣本類型的樣本，市面上很多廠家的產(chǎn)品都沒有相關(guān)的驗(yàn)證數(shù)據(jù)，客戶如有需要可以自行測試。需要注意的是，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。樣品中含有影響生物活性的物質(zhì)會影響檢測結(jié)果。

Q5

試劑盒在使用前要室溫放置30min，

目的是什么？

A: ELISA試劑盒對于溫度的要求比較嚴(yán)格，溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素，這樣做主要是為了使試劑溫度一致，在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地滿足測定要求。

Q6

樣本收集后不能及時(shí)檢測，低溫保存

可以放多久？

A: 樣本收集后應(yīng)盡快檢測。如果樣本收集后不能立即檢測時(shí)：一周內(nèi)可檢測則需將樣本置于4℃環(huán)境下，冷藏保存。3年內(nèi)檢測則需將樣本至于-20℃或更低溫度環(huán)境下保存。

Q7

樣品反復(fù)凍融影響大嗎？

A:樣品反復(fù)凍融對蛋白影響非常大，能導(dǎo)致蛋白降解，非常不建議反復(fù)凍融樣品。一般蛋白含量豐富的樣本例如血清/血漿反復(fù)凍融1-2次，對于檢測結(jié)果影響不是非常大。

Q8

生物素化制劑和酶結(jié)合物，稀釋后沒用完，

還可以再用嗎？

A: 復(fù)溶的生物素化制劑和酶結(jié)合物建議依據(jù)使用說明書內(nèi)的有效期和儲存條件使用，放置時(shí)間太長可能會影響其活性。可根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)所需用量進(jìn)行配制，不建議過量配制。

Q9

振蕩器的選擇

A: 建議采用酶標(biāo)板振蕩器(單板/多板)，保持震蕩速率在500 shakes/min。定軌搖床因速率過慢，不建議使用。

當(dāng)所用產(chǎn)品的檢測原理為競爭ELISA法時(shí)，振蕩器的軌道直徑（振幅）更加重要。選好振蕩器能夠確保在競爭法ELISA中抗原與抗體的充分結(jié)合，才能得到理想結(jié)果。RSR采用德國IKA MTS 2/4振蕩器，如下圖所示。

該產(chǎn)品軌道直徑3mm，支持1-4個(gè)ELISA板同時(shí)振蕩，且能夠確保微孔板在振蕩時(shí)既不會松脫也不會有液體飛濺。當(dāng)您不確定實(shí)驗(yàn)室的振蕩器是否滿足ELISA實(shí)驗(yàn)規(guī)定時(shí)，可進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確保得到穩(wěn)定重現(xiàn)性。但這種測試費(fèi)時(shí)費(fèi)板，建議選擇相關(guān)參數(shù)的振蕩器。

Q10

變異系數(shù)(CV)較大的原因？

A: 

Q11

標(biāo)準(zhǔn)曲線較差？

A: 

* 振蕩器的振速與振幅也不容忽視，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整振蕩器參數(shù)或更換符合標(biāo)準(zhǔn)的振蕩器。

** RSR ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品可直接使用，避免標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、復(fù)溶不當(dāng)?shù)炔僮魇д`。

Q12

高背景或陰性對照值偏高

A: 

*工作臺用漂白劑做過清潔：殘留漂白劑可以氧化TMB導(dǎo)致非特異性高信號，需要去除殘留

Q13

顯色信號弱

A: 

Q14

無顯色信號

A: 

Q15

標(biāo)曲佳但樣品孔無信號

A: